Het uitschakelen van mismatch-reparatiegenen vertraagt de groei van Huntington-herhalingen in menselijke neuronen

Wetenschappers gebruikten cellen van iemand met de ziekte van Huntington (HvH) om te testen of het verlagen van de niveaus van DNA-reparatiegenen de groei van de schadelijke CAG-herhaling kan vertragen. In deze menselijke cellen die in het lab zijn gekweekt, groeide de herhaling inderdaad langzamer. Dit suggereert een mogelijke therapeutische strategie om het begin en de progressie van de ziekte mogelijk te vertragen, hoewel dit werk zich nog in een vroeg stadium bevindt.

Waarom uitbreidende CAG-herhalingen belangrijk zijn bij HvH

HvH wordt veroorzaakt door een abnormaal lang stuk van drie DNA-letters, CAG, in het huntingtine-gen, vaak afgekort tot HTT. Over het algemeen wordt de toenemende lengte van de uitgebreide CAG-herhaling geassocieerd met mensen die eerder symptomen van HvH vertonen en een snellere ziekteprogressie doormaken.

We weten nu dat voor mensen met HvH de CAG-lengte die iemand heeft geërfd, niet voor het leven vaststaat. In sommige cellen, vooral in een hersengebied ongeveer in het midden van het hoofd, het striatum genoemd, kan de CAG-herhaling gedurende vele jaren langzaam langer worden. Dit proces wordt somatische expansie genoemd – uitbreiding van de CAG-herhaling in “somatische” cellen, oftewel lichaamscellen.

Bewijs uit menselijk hersenweefsel en dieren die HvH nabootsen, suggereert dat deze extra groei (somatische expansie) een belangrijke oorzaak is van de kwetsbaarheid van deze neuronen en een grote factor is bij het aandrijven van de ziekteprogressie.

DNA-reparatie: een belangrijke motor achter CAG-expansie

Ons DNA wordt voortdurend beschadigd door zaken als UV-straling van de zon, milieuvervuiling en stress binnenin onze cellen. Maar cellen zijn altijd bezig om deze schade in hun DNA te herstellen. Een cruciaal systeem dat verantwoordelijk is voor het behoud van de integriteit van het genetisch materiaal wordt Mismatch Repair (MMR) genoemd. Het werkt als een moleculaire corrector die kleine fouten opspoort en corrigeert om de genetische integriteit te waarborgen.

De sterk herhalende CAG-sequentie in het HTT-gen is echter structureel onstabiel en kan ongebruikelijke vormen aannemen, zoals lussen van DNA. Wanneer componenten van het MMR-systeem deze vreemde structuren tegenkomen, wordt gedacht dat het reparatieproces de DNA-lettercode verkeerd leest, een beetje zoals een spellingscontrole die typefouten accepteert.

Deze correctiefouten door het MMR-systeem kunnen leiden tot het invoegen van extra herhalingen. In deze context wordt het MMR-systeem, dat normaal gesproken de genetische code beschermt, onbedoeld een belangrijk mechanisme dat de schadelijke uitbreiding van de CAG-herhaling aandrijft.

Deze destructieve rol van MMR bij het bijdragen aan HvH wordt sterk ondersteund door langdurig onderzoek. Grootschalige genetische studies, bekend als Genome-Wide Association Studies (GWAS), bij mensen met HvH bevestigden dit verband door natuurlijke genetische verschillen (varianten) te identificeren in verschillende MMR-geassocieerde genen die de leeftijd beïnvloeden waarop de symptomen beginnen.

Deze bevindingen boden overtuigende therapeutische strategieën. Als we de activiteit of niveaus van specifieke MMR-genen veilig kunnen verlagen, kunnen we dit expansieproces mogelijk effectief vertragen bij de bron.

Mismatch-reparatie bestuderen in menselijke Huntington-neuronen

Het meeste eerdere onderzoek naar mismatch-reparatie en CAG-expansie maakte gebruik van muizen die HvH nabootsen of dierlijke cellen die in een schaaltje zijn gekweekt. In een recente studie onder leiding van dr. Sarah Tabrizi van University College London gebruikten de onderzoekers een systeem dat directer relevant is voor mensen.

Ze begonnen met huidcellen gedoneerd door een zevenjarig meisje met juveniele HvH, die een zeer grote uitgebreide CAG-herhaling van meer dan 125 in het HTT-gen droeg. De wetenschappers voegden moleculen toe die de huidcellen aanzetten om stamcellen te worden, die in staat zijn tot zelfvernieuwing en gestuurd kunnen worden om verschillende celtypen te worden, waaronder hersencellen.

Met behulp van protocollen waarbij op verschillende tijdstippen verschillende chemicaliën worden toegevoegd, zette het team de Huntington-stamcellen om in hersencellen die rijk zijn aan medium spiny neurons (MSN’s). Deze worden gevonden in het striatum, een centraal hersengebied dat zwaar wordt aangetast door HvH. MSN’s zijn specifieke hersencellen waarvan bekend is dat ze bijzonder kwetsbaar zijn voor degeneratie bij HvH. De onderzoekers maten consequent de lengte van de CAG-herhaling in zowel de delende stamcellen als deze hersencelculturen om te volgen hoe de herhalingslengte in de loop van de tijd veranderde.

Een moleculaire dimschakelaar gebruiken

Om de rol van mismatch-reparatie te testen, gebruikten ze een krachtig genetisch hulpmiddel genaamd CRISPR-interferentie (CRISPRi). CRISPRi werkt als een moleculair systeem om de genactiviteit in één gen tegelijk heel precies te verminderen. Dit systeem verschilt van standaard genbewerking omdat het DNA niet doorknipt. In plaats daarvan gebruikt het een molecuul dat je kunt zien als een moleculaire schaar, genaamd Cas9, dat op moleculair niveau is vastgemaakt aan een dimschakelaar die effectief de niveaus van een doeleiwit verlaagt.

Het team gebruikte CRISPRi om de activiteit te verminderen van mismatch-reparatiegenen die waren geïdentificeerd in de menselijke genetische studies (GWAS). Ze richtten zich ook op de partners van die MMR-genen. De doelgenen omvatten componenten uit de multi-proteïnecomplex-families, de MutS-familie (MSH2, MSH3, MSH6) and de MutL-familie (MLH1, PMS1, PMS2, MLH3), samen met het enzym DNA-ligase 1 (LIG1).

Het doel van de studie was om hun activiteit te verlagen tot niveaus die haalbaar zijn met therapeutische medicijnen, in plaats van de genen volledig te elimineren. Deze aanpak stelde hen in staat om realistischer na te bootsen wat als behandeling ontwikkeld zou kunnen worden, of om die varianten te imiteren die van nature voorkomen bij mensen met HvH die pas op latere leeftijd symptomen kregen.

Vervolgens controleerden de onderzoekers of hun experimenten succesvol waren, dus deden ze een ander experiment genaamd een “MMR-deficiëntie-assay”. Hiermee konden ze bevestigen dat ze de activiteit van de MMR-doelgenen daadwerkelijk verlaagden. Om dit te doen, behandelden ze de cellen met een chemische stof die DNA-schade nabootst. In cellen met een volledig functionerend MMR-systeem veroorzaakt deze stof normaal gesproken celdood. Maar als de MMR-functie is aangetast, kunnen cellen overleven.

Het experiment bevestigde dat het MMR-systeem in de gemodificeerde cellen verzwakt was, wat bleek uit een verhoogde overleving van de cellen in vergelijking met de controles. Belangrijk is dat de verminderde functie niet totaal was, wat aansluit bij het doel van gedeeltelijke vermindering en de onderzoekers een systeem geeft waarmee ze de niveaus van deze genen moleculair kunnen dimmen om ze zachter te zetten in plaats van uit.

De impact van het dimmen van MMR-genen op CAG-expansies

Ten slotte keken ze naar de snelheid waarmee de CAG-herhaling uitbreidde in zowel de delende stamcellen als de gespecialiseerde striatale neuronen, waarbij ze de expansiesnelheden vergeleken met en zonder de verminderde activiteit van de mismatch-reparatiegenen.

In de Huntington-stamcellen werd de CAG-herhaling normaal gesproken na verloop van tijd langer, wat verwacht werd. Maar toen verschillende mismatch-reparatiegenen werden gedimd met CRISPRi, vertraagde deze groei, wat suggereert dat de theorie van het team klopte! De sterkste vertragende effecten werden gezien wanneer het team de belangrijkste MutS-componenten (MSH2 en MSH3) en de kerncomponent van MutL (MLH1) verminderde. Het verlagen van deze genen verminderde de expansiesnelheid in de delende stamcellen met 60% tot 65%, terwijl andere MutL-factoren (PMS1, PMS2 en MLH3) de snelheid met 25-35% verminderden.

Het belangrijkste was dat soortgelijke patronen werden gezien in de hersencelculturen die gemaakt waren van dezelfde Huntington-stamcellen. De onderzoekers richtten zich strategisch op de MutL-factoren (PMS1, PMS2 en MLH3) in neuronen, omdat eerdere stamcelexperimenten MSH6 en LIG1 hadden uitgesloten, en MSH2 potentiële veiligheidsrisico’s met zich meebracht vanwege het risico op kanker. Ze deden ook geen diepgaand onderzoek naar MSH3, omdat dit elders al actief wordt onderzocht als therapeutisch doelwit.

In de neuronen vertraagde deze expansie met 69% wanneer MLH1 was gedimd, en het aanpakken van PMS1, PMS2 of MLH3 vertraagde de expansie ook met meer dan 20% vergeleken met de controlecellen. Dit toont aan dat mismatch-reparatie een belangrijke motor blijft van somatische expansie in menselijke Huntington-neuronen, en niet alleen in delende stamcellen of bij muizen. Bovendien laat het zien dat onderzoekers door het aanpassen van de niveaus van deze specifieke MMR-genen de somatische expansie aanzienlijk kunnen vertragen. Een zeer opwindend vooruitzicht!

Wat de studie heeft gevonden en wat het niet aantoont

In gewone taal is de kernboodschap van dit onderzoek: In menselijke neuronen die in een schaaltje zijn gekweekt en afkomstig zijn van iemand met HvH, lijkt het dimmen van mismatch-reparatiegenen voldoende om de groei van de schadelijke CAG-herhaling te vertragen.

Dit werk is bemoedigend voor het idee van “anti-expansie”-therapieën. Tegelijkertijd is het belangrijk om duidelijk te zijn over wat deze studie niet aantoont. Al het werk is gedaan in cellen in schaaltjes, niet in levende hersenen. Er is slechts één stamcellijn voor juveniele HvH gebruikt, met een zeer lange herhaling.

De studie mat de lengte van de CAG-herhaling en de verdeling ervan. Het testte niet de overleving van neuronen, gedrag of hersenfunctie. Ook werd de veiligheid op de lange termijn niet onderzocht. Mismatch-reparatiegenen helpen alle weefsels te beschermen tegen kanker, en het veranderen van hun activiteit bij mensen brengt risico’s op het veroorzaken van kanker met zich mee, vooral omdat het verlies van genen zoals MSH2 en MLH1 geassocieerd wordt met een aanzienlijk verhoogd risico op kanker van het zenuwstelsel, waarbij PMS2 ook enig risico met zich meebrengt.

Wat het werk wel oplevert, is een realistischere shortlist van mismatch-reparatiegenen die veelbelovend lijken in een menselijke Huntington-context, waarbij leden van de MutL-familie, met name PMS1, als potentiële doelwitten naar voren komen. Het ondersteunt het idee dat het voorzichtig verminderen van de activiteit van geselecteerde mismatch-reparatiegenen, waarschijnlijk in matige mate en mogelijk in combinatie, een waardevolle manier zou kunnen zijn om CAG-expansie te vertragen. Deze informatie kan helpen bij het ontwerpen en prioriteren van toekomstige therapieën die niet alleen gericht zijn op het behandelen van symptomen, maar op het veranderen van het tempo van de ziekte van Huntington zelf.

Samenvatting

• Mismatch-reparatie drijft CAG-expansie aan in menselijke neuronen: Met behulp van hersencellen die zijn gemaakt van een persoon met HvH en in een laboratoriumschaaltje zijn gekweekt, hebben onderzoekers bevestigd dat het mismatch-reparatiesysteem de groei van CAG-herhalingen in menselijke neuronen aanstuurt, en niet alleen bij muizen of delende cellen.
• Het dimmen van reparatiegenen vertraagde de expansie: Door de activiteit van specifieke mismatch-reparatiegenen gedeeltelijk te verminderen, vertraagde het team de groei van de CAG-herhaling met wel 69% in neuronen, waarbij leden van de MutL-familie, met name PMS1, naar voren kwamen als potentiële therapeutische doelwitten.
• Genetische bevindingen hebben nu experimentele ondersteuning in menselijke cellen: Grote genetische studies wezen eerder al op mismatch-reparatiegenen als beïnvloeders van het begin van HvH. Deze studie bevestigt hun rol in menselijke neuronen die in een laboratoriumschaaltje zijn gekweekt en helpt bij het prioriteren van welke genen moeten worden aangepakt. Het werk is gedaan in een enkele cellijn in een schaaltje, maar het is een belangrijke stap naar therapieën die gericht zijn op het vertragen van CAG-expansie.