Een stap vooruit voor genbewerking: CRISPR-Cas9 en ZvH

CRISPR-Cas9 is een experimentele genbewerkingtechniek die wordt gebruikt om precieze veranderingen in DNA aan te brengen. Voor het eerst hebben wetenschappers deze aanpak gebruikt om de ziekte van Huntington-mutatie aan te vallen in de hersencellen van een muis. Andere onderzoekers verfijnen CRISPR-Cas9 om het efficiënter, specifieker en veiliger te maken. Het is nog ver verwijderd van gebruik bij ZvH-patiënten, maar de toepassing bij muizen is een spannende stap voorwaarts.

Genbewerking met CRISPR-Cas9

DNA is de fundamentele code die de groei en functie van levende cellen stuurt. Ons vermogen om deze code te manipuleren, ooit sciencefiction, begint nu onderzoek naar erfelijke aandoeningen zoals de ziekte van Huntington te sturen. Het ontwerpen en toepassen van hulpmiddelen om DNA te veranderen staat bekend als genbewerking, en een hulpmiddel dat recent aandacht heeft gekregen heet CRISPR-Cas9. Sinds de introductie ervan hebben ZvH-wetenschappers de mogelijkheid onderzocht of CRISPR-Cas9 gebruikt zou kunnen worden om de genetische mutatie die ZvH veroorzaakt te verwijderen.

Deze experimentele techniek is nog niet klaar om bij mensen te proberen, maar is snel van reageerbuizen naar levende cellen naar organismen gegaan. Recent werk van meerdere onderzoeksgroepen heeft aangetoond dat CRISPR-Cas9 kan worden gebruikt om het ZvH-gen in de hersenen van een levende muis te bewerken. Nog spannender is dat de nieuwste bevindingen van één laboratorium verbeterd ZvH-muisgedrag laten zien na het toedienen van CRISPR-Cas9 aan de hersenen. Deze genbewerkingtechnologie blijft geavanceerder worden, en verschillende ZvH-onderzoeksteams passen het aan voor de uitdagingen van ZvH-therapie. Laten we bespreken hoe CRISPR-Cas9 werkt, de toepassing ervan op ZvH, en waarom veiligheid in dit stadium een zorg is.

Het ZvH-gen: het verhaal bewerken

ZvH wordt veroorzaakt door een ongewenste toevoeging aan de genetische code. Miljarden biologische bouwstenen, de nucleotiden C, G, A en T, worden gevonden in de volledige DNA-code. Deze nucleotiden worden gelezen en geïnterpreteerd in stukken – secties van het gen bekend als exonen. Je kunt een nucleotide zien als een letter, drie nucleotiden als een woord, een exon als een zin, het gen als een alinea, en het complete genoom als een handleiding die alle onderdelen beschrijft die nodig zijn voor cellen om te groeien en te functioneren.

Laten we inzoomen op één alinea van het verhaal, het gen dat ZvH veroorzaakt. Bij mensen die voorbestemd zijn om ZvH te ontwikkelen, bevat de eerste zin een fout: een reeks C-A-G letters die doorgaat… en doorgaat en doorgaat en doorgaat en doorgaat en doorgaat en doorgaat en doorgaat en doorgaat en doorgaat en doorgaat en doorgaat en doorgaat en doorgaat en doorgaat en doorgaat… vele malen meer dan nodig. Wat als we de CAG-herhaling fout konden bewerken, zoals het verwijderen van al die extra “doorgaat en” herhalingen uit de vorige zin? Dit is de hoofdfocus van genbewerking in ZvH-onderzoek, en CRISPR-Cas9 is een van de verschillende benaderingen.

CRISPR-Cas9: de knip maken

Er is geen equivalent van tekstverwerking software om genen te bewerken. Om genen op microscopische schaal te repareren, één cel tegelijk, moet de foutieve code worden gelokaliseerd en fysiek worden geknipt – en dat is wat CRISPR-Cas9 doet. Dit knippen vereist twee componenten: (1) een gids-RNA en (2) een knipenzym genaamd Cas9. Hier is een eenvoudige analogie: stel je voor dat je een stuk lint wilt knippen, maar je vriend heeft de schaar. Je zou het lint met twee handen kunnen vasthouden, strak trekkend om je vriend precies te laten zien waar te knippen. Dat is CRISPR-Cas9, op microscopische schaal: het gids-RNA vindt en presenteert de juiste plek op het DNA, en de Cas9 fungeert als de schaar, die daadwerkelijk het DNA knipt.

In het laboratorium kunnen wetenschappers specifieke gids-RNA’s ontwerpen die Cas9 laten zien waar twee keer te knippen, aan beide kanten van de extra lange reeks C-A-G herhalingen in het ZvH-gen. Dan kunnen de nieuwe uiteinden aan elkaar worden geplakt, waardoor het storende deel permanent wordt verwijderd. Dit is hoe wetenschappers CRISPR-Cas9 gebruiken om genetische sequenties te bewerken.

Zoals bij elke spannende nieuwe technologie, hebben onderzoekers met het CRISPR-Cas9 systeem gespeeld om nieuwe manieren te ontdekken om het hulpmiddel te gebruiken. Al vroeg realiseerden onderzoekers zich dat ze CRISPR-Cas9 konden gebruiken om vrij gemakkelijk enkele knippen in een specifiek gen te maken. Het reparatieproces dat cellen gebruiken om deze knippen te herstellen is foutgevoelig, en leidt vaak tot het verlies van kleine stukjes genetische informatie.

Als analogie, stel je voor dat je een bericht aan een vriend aan de eettafel typte dat zei: “geef alsjeblieft de boter door”. Als je per ongeluk een paar letters oversloeg – zeg “li” – maar de structuur van het bericht behield, zou je vriend ontvangen: “geefasjeb eftde boter door”. Wanneer genetische boodschappen zo in de war raken met kleine verwijderingen, hebben cellen mechanismen om de fouten te herkennen en hun inhoud te negeren. Dit geeft onderzoekers een manier om CRISPR-Cas9 te gebruiken om effectief een gen te verwijderen, in plaats van de sequentie op een meer specifieke manier te bewerken.

CRISPR-Cas9 in de hersenen van een ZvH-muis

Een paar onderzoeksgroepen hebben net ontdekt dat het mogelijk is om het ZvH-gen in de hersenen van een levende muis te bewerken. Meest recent ontdekte een team onder leiding van Xiao-Jiang Li, werkzaam aan de Emory University in de VS, dat het maken van kleine knippen in het ZvH-gen gunstige effecten kon hebben bij ZvH-muizen. Voor deze experimenten gebruikten ze CRISPR-Cas9 in de verwijder-modus, in plaats van het ZvH-gen te bewerken om de lange C-A-G te vervangen door een korte.

Om CRISPR-Cas9 in een ZvH-muis te gebruiken, worden het gids-RNA en de Cas9 “schaar” gedragen door speciaal ontworpen virussen die in de hersenen moeten worden geïnjecteerd. Li’s groep paste deze techniek toe op het striatum, een hersengebied dat stemming en beweging controleert en dat beschadigd raakt tijdens ZvH. Een paar weken later hadden de CRISPR-Cas9 componenten zich verspreid naar veel cellen, waardoor het disfunctionele ZvH-gen werd uitgeschakeld, en tekenen van stress op de neuronen waren verminderd.

Na drie maanden waren er minder schadelijke klonters van huntingtine-eiwit opgehoopt in hersencellen, en de ZvH-muizen hadden enigszins verbeterd op bewegingstests. Het meest opwindende aspect van dit experiment was het herstel van oudere muizen die al symptomen hadden ontwikkeld. Zelfs 9 maanden oude muizen (ongeveer middelbare leeftijd) verbeterden na het ontvangen van de injecties, wat suggereert dat hun hersenen gedeeltelijk konden herstellen na een half leven van schade.

Voorzichtig vooruitgaan

De meeste mensen met ZvH hebben slechts één kopie van het gemuteerde gen, en een andere kopie die perfect gezond is. Er is enige bezorgdheid over het gebruik van CRISPR-Cas9 als therapie, omdat het weliswaar het beschadigde deel van het ZvH-gen zou kunnen verwijderen, maar ook permanent een deel van de gezonde kopie zou kunnen verwijderen. Het Li-lab deed ook enkele experimenten om deze vraag indirect aan te pakken, werkend met muizen die twee defecte kopieën van het ZvH-gen hadden, en CRISPR-Cas9 gebruikten om beide te verwijderen. Er was geen onmiddellijk gevaar voor de muizen, hoewel ze slechts een paar weken werden gevolgd.

De veiligheid van het verstoren van de normale kopie van het ZvH-gen is belangrijk, gezien de lopende klinische studie van een huntingtine-verlagende ASO. Het medicijn verlaagt de niveaus van zowel de gemuteerde als de gezonde kopie van het ZvH-gen. Sommig onderzoek bij muizen heeft gesuggereerd dat dit onschadelijk is tijdens het latere leven, maar het is moeilijk om zeker te zijn, omdat de levensduur van een muis veel korter is dan die van een mens. De bedrijven die de ASO-studie uitvoeren – Roche en Ionis – zijn zich goed bewust van deze risico’s, en monitoren de deelnemers aan de studie zorgvuldig op eventuele tekenen van problemen veroorzaakt door het verlagen van het ZvH-gen.

Er zijn andere belangrijke verschillen tussen ASO-medicijnen en de CRISPR-Cas9 aanpak. De huidige ASO-studie bij mensen is een huntingtine-verlagende of gen-onderdrukkende therapie, die werkt om beide kopieën van het ZvH-gen in korte periodes uit te schakelen. Als de behandeling wordt gestopt, zal het gen zijn functie herstellen. Omgekeerd creëert genbewerking met CRISPR-Cas9 een permanente verandering in het DNA, en moet daarom met nog meer voorzichtigheid worden benaderd. Er is bewijs dat het ZvH-gen, beschadigd of niet, belangrijke functies in de cel heeft, en we willen geen risico lopen op permanente bijwerkingen. Het goede nieuws is dat ZvH-wetenschappers de uitdaging aangaan om de gezonde kopie van het gen te vermijden, bekend als een allel-specifieke benadering.

Verbetering van genbewerkingtechnieken

Twee groepen hebben onlangs de CRISPR-Cas9-techniek verbeterd, door deze te gebruiken om alleen de beschadigde kopie van het gen te knippen en te inactiveren. Een team onder leiding van Jong-Min Lee bij het Massachusetts General Hospital maakte een allel-specifieke verwijdering met slim ontworpen gids-RNA’s. De gidsen zochten naar kleine verschillen in de DNA-letters dicht bij de ZvH-mutatie en stuurden twee Cas9-knips aan. Hun aanpak is vernieuwend omdat genbewerkingen kunnen worden “gepersonaliseerd” afhankelijk van iemands DNA.

Een tweede groep, onder leiding van Beverly Davidson bij het Children’s Hospital of Philadelphia, gebruikte een vergelijkbare aanpak om alleen het gemuteerde gen te targeten, waarbij kleinere knips werden gemaakt met Cas9. Dit stopte de productie van meerdere schadelijke huntingtine-eiwitten. Net als Li’s groep konden ze ook het ZvH-gen in de hersenen van een levende muis inactiveren. Of een van beide bijgewerkte CRISPR-technieken het gedrag van een ZvH-muis zal verbeteren, moet nog blijken, maar beide innovaties zijn een stap in de richting van de genetische therapieën van de toekomst.

Uitdagingen voor genbewerking

We zijn enthousiast over het gebruik van genbewerking om ZvH beter te begrijpen. Het gebruik van CRISPR in een levende muis en de ontwikkeling van allel-specifieke benaderingen vertegenwoordigen belangrijke stappen voorwaarts, maar er zijn verschillende hindernissen te overwinnen voordat CRISPR-Cas9 zou kunnen worden ontwikkeld tot een ZvH-behandeling. Hier zijn de belangrijkste uitdagingen waarmee onderzoekers worden geconfronteerd, en onze huidige kennis:

1. Precisie: ervoor zorgen dat de Cas9 alleen het gen knipt waarvoor het ontworpen is, en geen willekeurige schade elders veroorzaakt. Wetenschappers lijken goed op weg om ervoor te zorgen dat CRISPR zeer specifiek is.

2. Allel-specificiteit: ervoor zorgen dat alleen de gemuteerde kopie van het HD-gen wordt verwijderd, en niet de gezonde. Het onderzoek dat we hier hebben beschreven is een spannende stap voorwaarts.

3. Toediening: ervoor zorgen dat het CRISPR-Cas9-systeem veel neuronen in de hersenen bereikt en het HD-gen uit elk daarvan verwijdert. We weten nu dat het mogelijk is in een muis, maar het blijft een grote uitdaging voor therapie in menselijke hersenen.

4. Veiligheid op korte termijn: ervoor zorgen dat het verwijderen van een deel van het HD-gen geen directe neurologische problemen of zelfs de dood veroorzaakt. Tot nu toe lijkt dit het geval te zijn.

5. Veiligheid op lange termijn: ervoor zorgen dat het bewerken van het HD-gen over een lange periode veilig zou zijn. Dit is een zeer moeilijke vraag om bij muizen te onderzoeken. We kunnen antwoorden vinden via experimenten met primaten, of via minder permanente technieken in klinische studies.

De huntingtine-verlagende ASO-studie bevindt zich nog in vroege veiligheidsfases, maar de aanpak heeft tot nu toe veelbelovende resultaten laten zien. Genbewerking zou blijvende veranderingen kunnen aanbrengen in de DNA-code, met verstrekkende gevolgen. Het veilig gebruiken van CRISPR-Cas9 wordt exponentieel uitdagender naarmate het dichter bij klinische toepassing komt. Toch toont de volgende generatie van deze technologie ongelooflijk veel potentie, en vele wetenschappers werken op innovatieve manieren aan de vooruitgang ervan.

Meer informatie

• Origineel manuscript over muizenonderzoek van het Li-lab (vrij toegankelijk)
• Origineel manuscript over het werk van het Lee-lab over allel-specifieke onderdrukking (volledig artikel vereist betaling of abonnement)
• Origineel manuscript over het werk van het Davidson-lab over allel-specifieke onderdrukking (vrij toegankelijk)