Op visjacht: proteïnenetwerkscreen identificeert nieuwe therapeutische doelen bij de ziekte van Huntington

Het gemuteerde huntingtin-eiwit veroorzaakt geen schade in isolatie – alle eiwitten werken in verbonden netwerken. Onderzoekers van het California Buck Institute for Research on Aging hebben een grootschalige screening uitgevoerd om proteïnenetwerken te identificeren die mogelijk de schadelijke effecten van de Huntington-mutatie verlichten of verergeren. Zou het manipuleren van deze netwerken nieuwe therapeutische opties voor HD kunnen bieden?

Het Huntingtin-eiwit: tot de kern van de zaak

2013 markeert de 20e verjaardag van de ontdekking van de genetische oorzaak van de ziekte van Huntington. Voor het eerst leerden wetenschappers dat een herhalende DNA-sequentie in een enkel gen abnormaal lang was bij mensen die HD ontwikkelen. Elk van onze genen geeft de instructies die onze cellen nodig hebben om een bepaald eiwit te maken, wat in het geval van het HD-gen een eiwit is dat we huntingtin noemen. Mutatie van deze genetische instructieset zorgt ervoor dat het huntingtin-eiwit wordt gebouwd met een fout, wat leidt tot subtiele veranderingen in het cellulaire gedrag van het eiwit. Naarmate een persoon met HD ouder wordt, hebben deze veranderingen ernstige gevolgen, vooral binnen de neuronen van de hersenen.

Deze baanbrekende ontdekking maakte het mogelijk voor wetenschappers om hun inspanningen te richten op een zeer specifieke taak; om de ziekte echt te begrijpen, zouden ze alles moeten leren over het huntingtin-eiwit zelf. Dit betekent niet alleen weten wat het huntingtin-eiwit doet in het lichaam van een gezond individu, maar ook wat er misgaat bij de ziekte.

Wat zou er zo belangrijk kunnen zijn aan één eiwit?

Eiwitten worden vaak beschreven als specifieke ‘functies’ hebbend in de cel. Om te begrijpen wat dit betekent, kan het helpen om elke cel in ons lichaam voor te stellen als een drukke fabriek. Het kost veel verschillende mensen die veel verschillende banen doen om de operaties van een fabriek soepel te laten verlopen. Al deze werknemers hebben een specifieke set vaardigheden, en als één persoon faalt in het goed doen van zijn werk, staat de productiviteit van de hele fabriek op het spel.

Nou, als onze cellen als fabrieken zijn, zouden eiwitten de werknemers zijn. Net als de individuele arbeiders, moet elk eiwit een set taken doen, of ‘functies’. Wanneer het huntingtin-eiwit gemuteerd is bij HD, beïnvloedt het de manier waarop huntingtin zijn functies uitvoert.

Net zoals geen enkele persoon elke baan in de fabriek zou kunnen doen, werkt geen enkel eiwit volledig alleen. In plaats daarvan bestaat het als onderdeel van een netwerk van eiwitten die met elkaar interacteren om efficiënt als team te werken. Dus om de functie van een eiwit te begrijpen, moeten wetenschappers ook bepalen welke relatie het heeft met andere eiwitten in de cel.

Er is geschat dat ons DNA de instructies geeft om meer dan 30.000 verschillende eiwitten te construeren. Begrijpen hoe al deze eiwitten met elkaar verbonden zijn, en hoe ze beïnvloed kunnen worden bij HD, wordt een bijna overweldigende uitdaging.

Hypothese en ontdekking

Om te helpen omgaan met de complexiteit van moderne biologie, zijn sommige onderzoekers overgestapt van traditioneel ‘hypothese-gedreven’ onderzoek naar een benadering genaamd ‘discovery-driven‘ onderzoek.

Een hypothese is een voorspelling die een wetenschapper maakt gebaseerd op wat ze al weten. Een goede hypothese is er een die gemakkelijk getest kan worden. Hier is een eenvoudig voorbeeld: stel we hypothetiseren dat katten de voorkeur geven aan het eten van kip boven tonijn. Een manier om dit te testen zou kunnen zijn om twee bakken neer te zetten, elk met een keuze. Door het aantal verschillende katten te tellen dat elke bak benadert, wordt bewijs geleverd om de hypothese te ondersteunen of te verwerpen.

Hypothese-gedreven onderzoek werkt echt goed, mits je al een behoorlijke hoeveelheid weet over het specifieke ding dat je onderzoekt. Echter, wanneer je erachter wilt komen wat een eiwit doet in een netwerk van duizenden andere verschillende eiwitten, kan de vooruitgang behoorlijk langzaam gaan wanneer je slechts één vraag tegelijk stelt. Stel je voor dat je wilde uitvinden wat de favoriete was van katten uit 30.000 voedingsmiddelen – maar ze slechts twee tegelijk kon testen!

Discovery-driven onderzoek is een manier om biologische processen te benadrukken die betrokken kunnen zijn bij een ziekte. Je zou kunnen zeggen dat deze benadering geen antwoorden genereert, maar betere vragen. Het vertelt onderzoekers waar ze hun aandacht op moeten richten voor toekomstige studies.

Discovery-driven experimenten, genaamd screens, omvatten duizenden verschillende mini-experimenten die gelijktijdig worden uitgevoerd.

In sommige opzichten zijn biologische screens een beetje zoals het verschil tussen vissen met een trawlnet in plaats van een hengel en lijn. Het is een krachtige techniek, maar vereist meer inspanning om door te sorteren wat gevangen is.

Individuele genen het zwijgen opleggen met RNAi

Een nieuwe studie gepubliceerd in het tijdschrift PLOS Genetics, geleid door Dr. Robert Hughes van het California Buck Institute for Research on Aging, beschrijft een discovery-driven screen die zoekt naar proteïnenetwerken die beïnvloed worden door gemuteerd huntingtin. Met behulp van een technologie genaamd RNAi, werkte Hughes’ team om individuele eiwitten te identificeren die mogelijk bijdragen aan de schadelijke effecten van het gemuteerde eiwit.

RNAi staat voor RNA interference, en is een vorm van ‘gen silencing’. RNAi wordt gebruikt om het niveau van een enkel eiwit in de cel te verminderen. Dit helpt te bepalen wat dat eiwit zou kunnen doen en het belang ervan voor andere cellulaire activiteiten.

RNAi onderschept de chemische boodschap die geproduceerd wordt wanneer een eiwit wordt gemaakt, en vernietigt het – waardoor wordt voorkomen dat het eiwit wordt gebouwd. Vrijwel elk gen en het bijbehorende eiwit kan worden gericht met RNAi.

Een RNAi-screen en enkele toxische fragmenten

Eerst kweekte Hughes’ team cellen in het lab die genetisch gemodificeerd waren om ze het meest schadelijke deel van het gemuteerde huntingtin-eiwit te laten produceren. Dit gemuteerde huntingtin-‘fragment’ zorgt ervoor dat de cellen sneller sterven als de juiste voedingsstoffen niet beschikbaar zijn. De gezondheid van de cellen kan worden beoordeeld door veranderingen te meten die optreden wanneer een cel sterft.

Om eiwitten te identificeren die betrokken zijn bij de schadelijke effecten van gemuteerd huntingtin, gebruikten Dr. Hughes en collega’s een ‘bibliotheek’ van meer dan 7.000 RNAi-chemicaliën, elk gericht op een ander eiwit.

Die 7.000 RNAi-chemicaliën werden elk getest op een aparte batch cellen. Op deze manier konden de onderzoekers de effecten analyseren van elk eiwit dat ‘uitgeschakeld’ werd. Als het het zwijgen opleggen van een gen de cellen sneller doet sterven, suggereert dit dat het bijbehorende eiwit normaal gesproken de cel zou kunnen beschermen. En als de cellen langzamer sterven, betekent het dat het eiwit de zaken bij HD zou kunnen verergeren.

De cijfers verwerken

Experimenten zoals dit produceren een hoop data, dus computers worden gebruikt om het te analyseren en er betekenis aan te geven. Gelukkig zijn veel proteïnenetwerken al in kaart gebracht met meer traditionele wetenschappelijke benaderingen.

De computer creëert een nieuwe kaart, waarbij de ‘hits’ van de nieuwe data op de bestaande netwerkkaart worden geplaatst. Met deze techniek vond Hughes’ team enkele netwerken die meer hits hadden dan verwacht, wat aangeeft dat ze belangrijk zouden kunnen zijn voor de ontwikkeling van de ziekte van Huntington.

Sommige van deze netwerken waren al bekend uit eerdere studies, wat de wetenschappers vertrouwen gaf dat hun discovery-gebaseerde benadering werkte. Echter, ze kwamen ook netwerken tegen die nog niet eerder geïmpliceerd waren bij HD. Eén netwerk in het bijzonder, verbonden met huntingtin via een eiwit genaamd RRAS, werd benadrukt door de screen.

Vanwege de enorme aantallen betrokken, is het belangrijk om aparte follow-up experimenten te doen om de meest opvallende bevindingen te verifiëren. Dus Hughes’ team deed experimenten in verschillende celmodellen, evenals in een HD-fruitvliegmodel, en vond dat RRAS in staat was te beschermen tegen celdood. Nog beter, ze konden specifieke activiteiten van de eiwitten binnen het netwerk aanwijzen die het gemakkelijkst te richten zouden kunnen zijn met medicijnen.

Onze grenzen kennen

Het meest opwindende aspect van deze studie is dat het nieuwe netwerken benadrukte die betrokken kunnen zijn bij de ziekte van Huntington. Echter, net zoals er geen visnet groot genoeg is om de hele oceaan te trawlen, werden waarschijnlijk enkele belangrijke proteïnenetwerken gemist met dit werk.

Een reden hiervoor is het celmodel dat gebruikt werd in de screen. In plaats van cellen het volledige gemuteerde huntingtin-gen te laten produceren, kozen de onderzoekers ervoor om slechts een klein fragment te gebruiken. Dat betekent dat alle eiwitten of netwerken die afhankelijk zijn van het volledige huntingtin-eiwit gemist zullen zijn.

Een andere reden is het celtype dat gebruikt werd in de experimenten. Dit werk werd gedaan met commercieel verkrijgbare cellen genaamd HEK293. Deze cellen zijn gemakkelijk te kweken in grote batches voor grootschalige experimenten zoals deze. Maar nadat ze gewijzigd zijn om zulke gemakkelijke eigenschappen te hebben, gedragen ze zich niet meer hetzelfde als een normale, gezonde cel in het lichaam – en zijn ze zeker heel anders dan neuronen.

Om te compenseren voor deze potentiële zwaktes in het experimentele model van de initiële screen, werden alle RNAi-‘hits’ opnieuw getest in cellijnen die volledige huntingtin produceren, evenals meer complexe fruitvliegmodellen van de ziekte. En het RRAS-netwerk werd onderzocht in een HD-muismodel.

Wat is de volgende stap?

Dit werk vertegenwoordigt een grote inspanning van de kant van de betrokken onderzoekers. Biologische screens vereisen veel zorgvuldige planning! Echter, met deze studie op zak, zou het team dit werk kunnen voortzetten door een vergelijkbare screen uit te voeren in cellen die volledige huntingtin bevatten.

Wat betreft de hits van de huidige screen, er is nog zoveel meer te verkennen. Een benadering zou kunnen zijn om het RRAS-netwerk te onderzoeken – of zelfs de screen te herhalen – in meer ‘accurate’ celmodellen, zoals stamcellen gegenereerd uit echte HD-patiënten.

Wat de toekomst van dit onderzoek ook mag brengen, dit is een goed voorbeeld van hoe discovery-driven onderzoek nieuwe doelen en ideeën kan genereren, mits we ons bewust blijven van de beperkingen van de technieken. We kijken ernaar uit om meer te leren over hoe deze nieuwe proteïnenetwerken de ontwikkeling van HD beïnvloeden, evenals hoe ze gemanipuleerd zouden kunnen worden in de zoektocht naar behandelingen.

Meer informatie

• Artikel van Hughes’ team in PLOS Genetics (open access)